自身免疫性溶血性贫血（AIHA）是一种由针对患者红细胞的抗体介导的获得性自身免疫性疾病。目前抗体产生的潜在机制尚未完全了解，对AIHA的病因和发病机制的研究主要集中在逃避耐受机制的自身反应性B细胞上，且较少有研究报道TFH和TFR细胞在AIHA过程中的功能。本研究旨在探讨TFH和TFR细胞在AIHA发病中的潜在机制。对于鼠类AIHA模型，据报道TFH：TFR的比例增加，血清IL-21和IL-6水平升高，以及Bcl-6和c-Maf表达上调。同样，从免疫小鼠中纯化CD4+CXCR5+CD25-T细胞的过继转移后促进了AIHA小鼠模型中自身抗体的诱导。以上数据证明了TFH细胞在控制和诱导AIHA中具有重要作用
结果1：CD4+CXCR5+CD25-TFH细胞在AIHA小鼠模型中的表达
为了研究TFH在AIHA中的作用，构建AIHA小鼠模型。在我们的模型中，5-6周内检测到红细胞自身抗体，之后6周一直持续增加。第12周，几乎所有的小鼠都产生了大鼠RBC特异性异种抗体，大约40%的小鼠进展为AIHA，其红细胞上存在特异性红细胞自身抗体，输注的小鼠红细胞被破坏，循环网织红细胞水平增加(图1A-E)。为了探讨TFH在AIHA小鼠模型中的差异，将输血受者分为无应答组(无自身抗体)和应答组(超过75%的红细胞具有红细胞特异性自身抗体)，流式细胞仪检测各组中CD4+CXCR5+CD25-Foxp3?TFH细胞的百分率。如图2A-C所示，应答组CD4+CXCR5+CD25-Foxp3?TFH细胞的百分比和数量明显高于无应答组和对照组。应答组ICOShiPD-1hi细胞的比例也高于无应答组和对照组。进一步分析发现，应答组CD4+CXCR5+CD25-Foxp3?TFH细胞百分率与自身抗体荧光强度呈中度正相关(图2F)。
图1图2结果2：CD4+CXCR5+FoxP3+细胞在AIHA小鼠模型中的表达
TFR细胞具有TFH和Treg细胞的共同特征，定位于B细胞滤泡，在体内调节TFH细胞群的大小和抗体应答。因此，我们检测AIHA小鼠模型中TFH数量增加和自身免疫反应，是否由于TFR亚群缩小所致。如图3A和图3B所示，应答组CD4+CXCR5+T亚群中CD25+和Foxp3+细胞的百分比低于无应答组和对照组，TFH/TFR比值高于应答组，且该比值与应答组自身抗体荧光强度呈中度正相关(图3C，D)。进一步分析指出，应答组TFR细胞数量略有减少(图3E)，提示TFR细胞比例降低是由于TFH细胞扩增所致。
图3
结果3：AIHA小鼠模型血清IL-4、IL-6、IL-21水平的变化
有研究表明，细胞因子IL-6和IL-21在TFH细胞的分化、功能中起重要作用。无论是否存在红细胞自身抗体，应答组和无应答组的血清IL-6水平均高于对照组(图4A)。对于血清IL-21水平，应答组比对照组高2倍(图4B)。前人的研究表明，IL-21和IL-6水平与自身免疫性疾病中TFH细胞的频率显著相关。在本研究中，血清IL-21水平与应答组中CXCR5+CD4+CD25Foxp3?TFH细胞百分比呈显著正相关(图4C)。此外，无应答组IL-21水平与CXCR5+CD4+CD25Foxp3?TFH细胞呈中度正相关，而对照组则无明显相关(图4D，E)，无应答组IL-21水平与CXCR5+CD4+CD25Foxp3?TFH细胞呈中度正相关(图4D，E)。在所有三组中，血清IL-6水平与这一参数之间没有数据关系(数据未显示)。除IL-21外，IL-4是TFH细胞分泌的另一种细胞因子，三组间无明显差异(图4F)。
图4
结果4：Bcl-6、c-Maf和IL-21mRNA在AIHA小鼠模型中的表达
转录因子Bcl-6和c-Maf以及细胞因子IL-21在TFH细胞的生成、分化和功能中起着至关重要的作用。检测三组中Bcl-6、c-Maf和IL-21mRNA的表达，反应组明显高于对照组(图5)。
图5
结果5：CXCR5+CD4+CD25-TFH细胞在AIHA发病过程中起促进作用
为了研究CXCR5+CD4+CD25-TFH细胞比例的增加是否在AIHA小鼠模型中起到了一定的促进作用，我们进行体外B细胞类开关重组试验的研究。从应答小鼠中分离出CD4+CXCR5+CD25-TFH和CD4+CXCR5+CD25-T细胞。这些细胞分别与CD19+B细胞(也是从应答组分离的)以及抗IgM和抗CD3一起培养。正如预期的那样，与CD4+CXCR5+CD25-T细胞相比，CD4+CXCR5+CD25-TFH细胞对B细胞类别转换IgG抗体的促进作用显著增加(图6A)。接下来，我们检测了GL7的表达，因为在这些检测中，GL7是GC中B细胞活化的敏感标志。用TFH细胞共同培养的B细胞表达Gl7的数量比与用CD4+CXCR5+CD25-T细胞共同培养的B细胞增加3-4倍(图6B)。此外，对TFH细胞的体内功能进行了研究。将应答组中的CD4+CXCR5+CD25-TFH或CD4+CXCR5+CD25-T细胞过继转移到幼龄C57BL/6J小鼠体内。移植后第二天，每周免疫一次大鼠红细胞，持续12周。如图6C所示，在过继转移TFH细胞的小鼠中，最早可在第二周检测到自身抗体阳性的红细胞，而在转移CD4+CXCR5+CD25-T细胞的小鼠中，几乎没有检测到自身抗体阳性的红细胞。这种高水平的自身抗体持续了12周。
图6
结果6：TFH细胞在应答者和非应答者群体之间的促进作用
我们将应答组和无应答组的CD4+CXCR5+CD25-TFH分别和CD19+B与抗IgM和抗CD3细胞共培养，比较了应答组和无应答组的TFH细胞表达的能力。如图7所示，IgG1和GL7在两组中的表达相似。因此，TFH细胞的促进能力在应答组和非应答组中没有明显改变(图7)。
图7
结论研究首次阐明了TFH细胞在AIHA发病过程中对RBC自身抗体产生的重要作用。虽然不能完全排除炎症环境对TFH升高的作用，但TFH细胞在B细胞分化及抗RBC抗体产生中的影响对理解AIHA的病理生理过程仍具有参考意义。
参考文献YuhanGao,HaiqiangJin,DingNan,etal.TheRoleofTFollicularHelperCellsandTFollicularRegulatoryCellsinthePathogenesisofAutoimmuneHemolyticAnemia.SciRep,Dec24;9(1):.预览时标签不可点收录于话题#个上一篇下一篇
