受理号：CSZ
体外诊断试剂产品注册技术审评报告
产品中文名称：α和β地中海贫血基因检测试剂盒（联合探针锚定聚合测序法）
产品管理类别：第三类
申请人名称：华大生物科技（武汉）有限公司
国家药品监督管理局
医疗器械技术审评中心
基本信息
一、申请人名称华大生物科技（武汉）有限公司二、申请人住所武汉市东湖新技术开发区高新大道号武汉国家生物产业基地项目B、C、D区研发楼B2栋三、生产地址武汉市东湖新技术开发区高新大道号武汉国家生物产业基地项目B、C、D区研发楼B2栋五楼、B1栋一楼技术审评概述
一、产品概述
（一）产品主要组成成分表1主要组成成分
（二）产品预期用途
本试剂盒用于文库构建，采用高通量测序技术（联合探针锚定聚合测序法）定性检测人外周血样本中基因组DNA的4种α-地贫缺失型、2种β-地贫缺失型、3种α-地贫非缺失型和16种β-地贫非缺失型。用于α和/或β地贫的辅助诊断（遗传诊断）。本试剂盒检测结果不作为地中海贫血临床诊断的唯一依据，仅供临床参考。表2试剂盒检测的地中海贫血基因变异信息
（三）产品包装规格
人份/盒（四）产品检验原理
根据α-地贫和β-地贫发生相关的HBA1、HBA2和HBB三个基因的特点设计一系列引物，以实现基因的有效扩增。利用多重PCR技术将样本中的HBA1、HBA2和HBB基因扩增富集并同时引入用于样本识别的标签序列。将多例（≤96例）样本的PCR产物按一定比例混合成一个文库，经过一系列的文库制备过程，每个文库中的样本DNA序列都加上了用于测序及文库识别的接头序列。将制备好的文库等质量比例上机测序，使用基因测序仪通过联合探针锚定聚合测序技术对各文库中的样本DNA进行序列信息读取。每一条DNA的测序结果经过文库接头序列、样本标签序列和引物序列比对拆分后将被精确定位到每一个样本的每一个扩增区域中。
将每个样本的目标区域的测序结果与以GRCh37基因组序列为参考构建的目标参考序列进行比对分析，再通过变异检测、阳性判断值以及来自于HbVar（年10月版）和Ithanet数据库（年10月版）的变异坐标信息与变异名称信息，判断样本中是否存在地贫基因变异以及何种变异。
二、临床前研究概述
（一）主要原材料1.主要原材料的选择试剂盒主要原材料包括：PCR标签引物、PCR反应液、PCR反应热启动酶、测序接头、末端修复缓冲液、T4多聚核苷酸磷酸激酶、T4DNA聚合酶（rTaq聚合酶）、KlenowFragment、加“A”酶、连接酶、磁珠、阳性对照品、阴性对照品等。主要原材料均为外购方式获得。PCR标签引物和测序接头为申请人自行设计后由专业的合成公司合成。申请人选择有资质的供应商提供原料，通过功能性试验筛选出最佳原材料和供应商，制定了各主要原材料质量标准并经检验合格。2.企业参考品和质控品设置情况企业参考品包括阳性参考品、阴性参考品、重复性参考品、精密度参考品、检测限参考品。阳性参考品37份，由外周血样本和细胞系样本组成，样本涵盖该产品可检出的所有变异类型的杂合型；阴性参考品14份，由外周血样本和细胞系样本组成，包含无变异样本、产品检测范围外的地贫变异类型样本及同源序列变异样本；重复性参考品5份，均为细胞系样本，涵盖产品可检出的4种代表性变异类型和1份无变异的阴性样本；精密度参考品5份，为包含弱阳性浓度水平在内不同浓度水平和无变异的外周血样本；检测限参考品4份，均为细胞系样本，每份检测限参考品做高、中、低3个水平的梯度稀释，涵盖该产品可检出的4种代表性变异类型；检测限参考品37份，由细胞系样本和外周血样本组成，包含产品可检出的所有变异类型的最低检出限水平。试剂盒包含4份阳性对照品和1份阴性对照品，用于检测过程的质量控制。阴阳性对照品均为细胞系样本，阳性对照品涵盖该产品可检出的4种代表性变异类型，阴性对照品为无变异样本。（二）生产工艺及反应体系研究申请人通过对多重PCR反应引物配比、PCR反应标签引物用量、PCR反应体系和反应条件、PCR产物混合比例、阳性对照检测方式、文库制备起始量、纯化磁珠用量、打断参数、末端修复反应体系、末端修复反应时间、加A反应体系、连接反应体系、筛选磁珠用量、样本有效序列数、上机文库数等条件进行筛选和优化，通过功能性试验，最终确定了最佳的生产工艺与反应体系。（三）分析性能评估分析性能评估包括核酸提取试剂性能研究、准确度、重复性、精密度、分析特异性、分析灵敏度等性能评估。针对核酸提取试剂性能研究，申请人采用临床样本平行比较了核酸纯化试剂和核酸提取试剂的提取性能，通过对比提取所得DNA的浓度和纯度，确定核酸提取试剂为该产品的配套提取试剂。准确度评估中，申请人分别在两种适配机型（基因测序仪（MGISEQ-）和基因测序仪（MGISEQ-））上使用三批试剂盒对企业参考品盘中的37份阳性参考品进行检测，阳性符合率为%。另外，申请人分别在两种适配机型（基因测序仪（MGISEQ-）和基因测序仪（MGISEQ-））上使用一批试剂盒对已知临床检测结果的临床样本进行检测，试剂盒检测范围内各变异类型的阳性符合率、阴性符合率和总符合率均为%。精密度评估中，申请人使用三批试剂盒对临界浓度10ng/μL和中高浓度15ng/μL的5份外周血样本和1份细胞系样本在两个实验室由两组操作者在不同适配机型（基因测序仪（MGISEQ-）和基因测序仪（MGISEQ-））的不同仪器上进行检测，每个浓度的每个样本重复检测3次，连续检测20天。检测结果均与已知结果一致。分析特异性评估中，申请人分别在两种适配机型（基因测序仪（MGISEQ-）和基因测序仪（MGISEQ-））上使用三批试剂盒对企业参考品盘中的14份阴性参考品进行检测，阴性符合率为%；对HbQ-Thailand、HbNewYork、HbJ-Bangkok等具有同源性序列的血红蛋白异常样本和--FIL、-α21.9、HbLepore-Boston-Washington等检测范围外的地贫变异阳性样本进行检测，检测结果均为未检出检测范围内的基因变异；对梯度稀释的血红素、甘油三酯、胆红素、肝素钠、EDTA?K2、甲磺酸去铁胺、地拉罗司分散片、叶酸片和爱乐维（复合维生素片）、布洛芬、盐酸氨溴索、蒲地蓝消炎胶囊、头孢克肟干扰样本进行检测，检测结果表明，当DNA样本中血红素浓度≤g/L、甘油三酯浓度≤0mg/dL、胆红素浓度≤2mg/dL、EDTA?K2浓度≤2.5mg/mL、甲磺酸去铁胺浓度≤1.6mg/mL、地拉罗司浓度≤1.6mg/mL、叶酸浓度≤0.38mg/L、爱乐维(复合维生素)平均浓度≤35.6mg/L、布洛芬浓度≤0.mg/mL、盐酸氨溴索浓度≤0.12mg/mL、头孢克肟浓度≤0.mg/mL、蒲地蓝消炎胶囊浓度≤2.86mg/mL时，干扰物质对试剂盒检测结果无明显影响，试剂盒具有较好的抗干扰能力。当样本中的肝素钠浓度在2IU/mL以上时，试剂盒检测失败率高，试剂盒不适用于检测肝素钠抗凝采血管采集的样本，样本采集应选用EDTA?K2抗凝采血管。最低检测限研究中，申请人分别在两种适配机型（基因测序仪（MGISEQ-）和基因测序仪（MGISEQ-））上进行了研究。首先选择产品可检出的4种代表性变异类型的细胞系样本进行梯度稀释，每个浓度梯度样本重复检测3次，将具有%检出率的最低浓度设定为预估最低检测限。之后，将包含所有申报位点的杂合型样本稀释至预估最低检测限浓度，每个样本重复检测20次，将检测结果为相应的基因型别且每个型别的检出率均≥95%时浓度，设定为最低检测限浓度。最后，申请人使用三批试剂盒对各个申报位点的杂合型样本进行重复检测20次，验证了最低检测限。（四）阳性判断值申请人使用该产品对例已有地贫基因检测结果的临床样本进行检测，对非缺失型的阳性样本进行突变频率的统计分析，基于理论杂合突变频率和纯合突变频率，利用Tukey’s检验确定非缺失型的阳性判断值；对缺失型阳性样本和阴性样本进行归一化序列的统计分析，利用k-medians聚类算法确定缺失型的阳性判断值。申请人使用该产品对例已有地贫基因检测结果的临床样本进行阳性判断值的验证。结果显示阳性符合率、阴性符合率和总符合率均为%，Kappa系数均为1。建立的阳性判断值能准确判断检测范围内的25种地贫变异类型的阴、阳性。（五）稳定性研究为考核该产品在不同条件下性能的稳定性状况，为试剂盒的包装、运输、使用和保存条件的确定和有效期的建立提供依据，申请人进行了稳定性研究，包括效期稳定性、冻融稳定性等。研究结果表明：包装盒1与包装盒2置于-18℃以下保存，包装盒3置于2℃～8℃保存，有效期为12个月；包装盒1、包装盒2冻融6次仍可有效检测；试剂盒每天开瓶1次连续开瓶7天、每2天开瓶1次连续2周、每周开瓶1次连续4周、每月开瓶1次4个月内开瓶小于4次仍可有效检测。适用样本稳定性研究：为考察该产品对不同条件下储存不同时间的样本的检出性能，申请人使用该产品分别对短期储存、长期储存的样本进行测试，最终确定外周血样本在室温下储存9天、在2℃～8℃储存14天、在-18℃以下储存9个月仍可有效检测；样本反复冻融次数应不超过6次；样本在2℃~8℃运输时，运输时间不超过8天。三、临床评价概述
申请人医院、珠海市妇幼保健院、医院共三家临床机构完成了临床试验。针对已有同类产品产品上市的基因型，采用试验体外诊断试剂与已上市同类产品进行比较研究；针对尚无同类产品上市的基因型，采用试验体外诊断试剂与Sanger测序法进行比较研究。临床试验的样本类型为外周血。入组病例包括具有地贫症状和/或体征的疑似地贫患者、血液学表现为小细胞低色素的疑似地贫患者、临床考虑为地贫携带者、需与地贫进行鉴别诊断的其他疾病患者等。对于尚无同类产品上市的基因型，提交了支持该基因型临床意义的临床试验资料及相关文献。临床试验共入组受试者例。有效样本中阳性样本例。各基因型别的阳性样本情况如下：α-地贫缺失型例，β-地贫缺失型7例，α-地贫非缺失型例，β-地贫非缺失型例。临床试验结果显示，该产品检测范围内的25个基因型别的检测结果与对比试剂/Sanger测序法相比的阳性符合率均为%、阴性符合率均为%、总符合率均为%。综上所述，该产品临床试验试剂符合《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》和《地中海贫血相关基因检测试剂注册技术审查指导原则》的相关要求。临床试验结果显示该产品与已上市同类产品一致性较好。四、产品收益风险判定
根据申请人提供的申报资料，经综合评价，在目前认知水平上，认为该产品的上市为适用人群带来的受益大于风险。但为保证用械安全，基于对主要剩余风险的规避，需要在说明书中提示以下信息：1.本试剂盒的检测结果仅供临床参考，不能作为诊断的唯一依据。对患者的临床诊断应结合临床症状/体征、病史、其他实验室检查等情况综合考虑；2.本试剂盒适用于人的外周血样本检测，不适用于其它样本检测；3.本试剂盒可以对4种缺失型α-地中海贫血、2种缺失型β-地中海贫血、3种非缺失型α-地中海贫血和16种非缺失型β-地中海贫血进行检测，但仍有检测范围之外的变异，可能造成漏检，这类样本可用其他方法进一步验证。4.不合理的样本采集、运送、处理、核酸过度降解以及未经验证的其他干扰或PCR抑制因子等均有可能会导致假阴性或假阳性结果。综合评价意见
本申报项目为境内第三类医疗器械产品注册，申请人的注册申报资料符合现行要求，依据《医疗器械监督管理条例》（国务院令第号）、《体外诊断试剂注册与备案管理办法》（国家市场监督管理总局令第48号）等相关医疗器械法规与配套规章，经系统评价后，建议准予注册。年3月31日来源：CMDE
整理：致众TACRO
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