上期，我们就新生儿溶血病（hemolyticdiseaseofthenewborn,HDN）的发病机制及临床特征进行了学习。鉴于HDN对胎儿或新生儿可能造成的严重危害，临床上有必要对HDN及早做出诊断，并根据检测结果采取必要的干预措施。本期，我们整理了HDN的实验室检测方法，来与大家共同学习。
一、产前孕妇血清学检测
1、目的：评估孕妇发生新生儿溶血病的风险。
2、对象：怀疑母婴血型不合者。
在胎儿血型未知的情况下，可以通过夫妇双方血型推测是否会发生母婴血型不合，凡符合表1情况的，均有可能发生母婴血型不合：
表1夫妇不配合血型
妻子血型
丈夫血型
0
A/B/AB
A
B/AB
B
A/AB
RhD-
RhD+
3、检查项目：
（1）夫妇双方ABO及Rh血型；
（2）孕妇血清IgG抗-A和/或抗-B抗体效价测定
对怀疑发生ABO血型系统不合者，需测定孕妇血清中IgG性质的抗-A和/或抗-B抗体的效价。值得注意的是，孕妇血清中的抗-A（B）抗体往往是IgM和IgG共存，引起HDN的只有IgG性质的，为准确测定IgG抗体效价，在实验前必须排除IgM的干扰。目前，实验室常用的方法是使用2-巯基乙醇（2-Me）或二硫苏糖醇（DTT）灭活IgM抗体，再对IgM充分灭活的血清做倍比稀释，使用间接球蛋白法检测IgG抗体效价。报结果时需要注意的是：由于灭活IgM时血清已被2-Me或DTT稀释过，因此使用生理盐水做倍比稀释的第1管应标注为1:4。
（3）ABO系统以外抗体检测
a.抗体筛选和鉴定:取孕妇血清与筛选红细胞做抗体筛选实验，若抗筛结果阳性，应进一步用普细胞进行抗体鉴定，以确定抗体的特异性；
b.确定夫妇相应的Rh血型：孕妇血清抗体筛选阳性者，可用孕妇血清来鉴定夫妇红细胞相应抗原。鉴定妻子血型可以印证抗体鉴定结果，鉴定丈夫血型可以确认胎儿是否可能受害。如果丈夫的红细胞不存在该抗体相对应的抗原，就排除了该抗体对胎儿的损害，同时需告诉妻子本人，不能输注含有该抗体所对应抗原的红细胞；
c.测定抗体效价：Rh阴性的妻子抗体测定应分别在妊娠20、28、34周进行，检出抗体后应该至少每4周检测一次。能引起HDN的不规则抗体多为IgG型，一旦检测出来则具有临床意义。
（4）IgG亚类测定
临床上常发生孕妇抗体效价很高但却未发生明显的HDN，相反，某些孕妇抗体效价并不高，却发生了明显的HDN，这种现象与IgG抗体的亚类有关。IgG抗体有4个亚类，即IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，各亚类与抗原结合后激活补体的能力顺序为IgG1IgG3IgG2IgG4，在体内引起新生儿溶血病的主要为IgG1和IgG3。免疫球蛋白亚类定量检测能帮助准确评估溶血的潜在风险。因此，有条件的实验室应对IgG抗体进行亚类检测。
二、产前胎儿血型基因型检测
运用PCR-SSP、PCR-RFLP等分子生物学技术可以从怀孕16周的孕妇羊水中检测出胎儿的血型基因，对于有HDN史或流产史的妇女，其丈夫基因为杂合型者，用分子生物学技术可以更早、更准确地预测胎儿的血型基因型，可选择性终止RhD阳性胎儿的妊娠，避免RhD阴性胎儿的一些侵入性损害检查。在ABO系统HDN的预测中，如母亲为O型，父亲为AO/BO型的夫妇，检测其胎儿ABO血型基因型，如胎儿为O型，完全可以排除HDN发生的可能，避免其他不必要的检查。如胎儿为AO/BO基因型，则提示有发生HDN的可能，从而指导临床在必要时进行其他检测。
三、产后新生儿血清学检测
1、目的：明确是否发生母婴血型不合及新生儿溶血病。
2、检测项目：
（1）患儿ABO及Rh血型鉴定
确定新生儿ABO血型只做正定型，不做反定型，或反定型结果仅供参考。这是因为新生儿尚未产生抗体，其抗体来源于母体。新生儿ABO血型正定型出现弱凝集也属于正常现象，因为新生儿ABO血型抗原尚未发育完全。
应该注意的是，直抗阳性会对血型鉴定结果产生干扰，最理想的方法是将红细胞采用合适的方法处理至直抗阴性，然后再进行血型鉴定。
（2）患儿红细胞直接抗人球蛋白试验
ABO系统HDN患儿红细胞上抗体结合往往较少，直抗试验常常阴性或弱阳性，可能是抗原和抗体之间的亲和力较弱，在洗涤过程中被洗脱掉；或是红细胞上致敏抗体分子较少，不足以和抗人球蛋白产生可见的凝集反应。这也是做HDN三项有时，出现放散阳性而直抗阴性的常见原因之一。使用改良方法如酶处理的红细胞做直抗试验，可提高阳性率。
Rh系统HDN患儿红细胞直抗试验往往出现2+以上的强阳性结果，这一特点可以辅助鉴别是ABO系统还是Rh系统引起的HDN。
（3）患儿血清游离抗体检测
患儿血清加上Ac、Bc、Oc红细胞悬液，然后可通过微柱凝集法、抗人球蛋白法、凝聚胺法或酶法鉴定游离IgG抗体的存在。结果解释可参照表2：
表2游离抗体检测结果分析
反应格局
结果判定
Ac
Bc
Oc
+
?
?
有游离抗-A抗体
?
+
?
有游离抗-B抗体
+
+
?
有游离抗-A、抗-B或抗-A，B抗体
+
+
+
有游离ABO系统以外抗体
?
?
?
无游离抗体
只有当患儿红细胞上存在与被检出抗体相对应的抗原时，该抗体才有意义。
（4）患儿红细胞抗体放散试验
采用合适的方法对红细胞进行放散，ABO系统抗体采用热放散，Rh系统抗体采用化学放散如乙醚或三氯甲烷-三氯乙烯放散法，然后取放散液进行抗体鉴定。方法及结果解释参照游离抗体鉴定。
直抗试验、游离抗体检测和放散试验称为HDN三项，其中放散试验是最有价值的一项，该项试验结果阳性即可确诊为HDN。当然，还需结合其他实验室检测结果如血常规、血胆红素含量及新生儿临床症状加以诊断。HDN三项试验检测结果分析参照表3：
表3HDN三项试验结果分析
直抗试验
游离抗体
放散试验
结果分析
+
+
+
有游离抗体，红细胞致敏
+
?
+
红细胞致敏
?
+
+
有游离抗体，红细胞致敏，直抗假阴性？#
+
+
?
有游离抗体，红细胞致敏，放散假阴性？
?
+
?
只有游离抗体，红细胞未致敏
?
?
+
红细胞致敏，直抗假阴性？#
+
?
?
可疑，直抗假阳性？
?
?
?
无抗体
#：对于直抗阴性而放散阳性这种情况，相信很多小伙伴们都遇见过。对于这种现象，可能是抗原和抗体之间的亲和力较弱，在洗涤过程中被洗脱掉；或是红细胞上致敏抗体分子较少，不足以和抗人球蛋白产生可见的凝集反应，直抗试验时使用的红细胞量又比较少，因此导致直抗阴性结果。而放散时使用的红细胞量比较多，最终放散下来的抗体量就相应地积少成多，最终出现放散阳性结果。
董树岭赞赏
