血栓和止血涉及机体的凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统等诸方面的功能,其缺陷可以引起出血性或血栓性疾病。虽然相关的检测目前已经开展得相当广泛,如何使这些检测指标在临床监测中发挥作用,为临床疾病的诊断和治疗提供准确的信息,是检验医学工作者面临的任务。
一、血栓和止血检测在出血病诊断中的应用
出血病由一期止血缺陷和二期止血缺陷导致,前者主要指血管壁和血小板缺陷导致的出血,而后者主要是由凝血、抗凝缺陷所导致。
1.一期止血缺陷参与一期止血的有血管内皮细胞、血小板及纤维蛋白原等,其数量和质量异常均可以导致出血。常用的筛选试验是出血时间和血小板计数。出血时间的延长可伴有血小板计数升高、正常或降低,均是出血病的实验室检查表现。血小板计数增高,部分患者患骨髓增殖性肿瘤(myeloproliterativeneoplasms,MPN),一些伴有JAK2VF突变,表现为出血时间延长,可有出血、血栓或无明显临床症状。血小板计数减少最多见于免疫性血小板减少症(immunethrombocytopeniapurpura,ITP)患者,是由各种原因引起的体内产生针对自身血小板的抗体所致。ITP的诊断目前多是排除性诊断。使用流式微球技术检测血小板上的自身抗体具有敏感性高、特异性强的特点。需要注意的是,相当多的患者出血时间延长合并血小板计数正常,此时不能忽视先天性或获得性血小板功能障碍性疾病的存在。前者较多见的是血小板无力症,后者常见于各种抗血小板治疗过程中。筛选试验阳性结果,往往需要进一步的实验室检测进行确诊。(1)血管性血友病(vonwillebranddisease,vWD)相关检测主要有血管性血友病因子抗原(vonwillebrandfactorantigen,vWF:Ag)、瑞斯托霉素辅因子、凝血因子Ⅷ活性(factorⅧcoagulantactivity,FⅧ:C)检测及瑞斯托霉素诱导的血小板聚集试验、凝血因子Ⅷ结合试验、胶原结合试验和血管性血友病因子(vonwillebrandfactor,vWF)多聚体分析等。根据上述试验的结果,可以将vWD分成1型、2型和3型。(2)血小板无力症相关检测,各种诱导剂诱导均无法引起血小板聚集反应;血小板膜表面CD41和CD61流式细胞检测明显降低甚至缺如。基层单位若无法实施上述检测,显微镜下可以观察到血涂片上血小板散在分布,无成簇聚集现象。服用抗血小板药物的患者,不同程度出现血小板聚集功能受抑制的情况。(3)低/无纤维蛋白原血症或异常纤维蛋白原血症患者可有出血时间延长或血小板聚集功能异常。患者的凝血酶时间(thrombintime,TT),活化部分凝血活酶时间(activatedpartialthromboplastintime,APTT)、止血时间(reptilasetime,RT)均有不同程度的延长,用clauss法结合免疫比浊法测定纤维蛋白原含量。
需要指出的是,作为一期止血的筛选试验,出血时间并未被淘汰,而是方法学上推荐使用模板法检测。国际上普遍使用PFA-检测血小板功能、抗血小板药物的疗效和vWD,具有操作简便、敏感性好和特异性强等特点。近来该款仪器已经升级换代为PFA-并在国内通过注册。
2.二期止血缺陷常用的筛选试验是凝血酶原时间(prothrombintime,PT)和APTT测定。该2医院开展频率最高的凝血常规检测项目。根据两者同时检测的结果,可以大致对凝血因子缺陷症进行分类。进一步行单个凝血因子的检测,可以对各类凝血因子缺陷性疾病作出诊断和鉴别诊断。临床上最多见的先天性凝血因子缺陷性疾病是血友病A(hemophiliaA,HA),绝大多数患者为男性,严重者出生后即可起病,表现为关节、肌肉和内脏反复出血。实验室检测发现APTT延长,PT正常,FⅧ:C降低,其他所有凝血因子活性正常。需要注意的是,由于各种原因引起的获得性血友病A(acquiredhemophiliaA,aHA)往往也表现为APTT延长和PT正常。一般可以用APTT纠正试验进行鉴别,若是一般的HA,患者延长的APTT可以被等量的正常人混合血浆所纠正,但若是由FⅧ:C抗体导致的APTT延长,APTT无法被等量的正常人混合血浆所纠正,这种异常随着血浆在37℃的孵育更加容易表现出来。
3.纤维蛋白溶解系统异常导致的出血纤维蛋白溶解系统组成复杂,作为该系统敏感的筛选试验,联合使用纤维蛋白(原)降解产物和D-二聚体可以完成。若仅纤维蛋白(原)降解产物升高,D-二聚体正常,往往提示患者为原发性纤维蛋白溶解功能亢进,此类患者用抗纤维蛋白溶解药物就能得到较好的效果。如纤维蛋白(原)降解产物和D-二聚体均显著升高,并出现血小板计数、纤维蛋白原进行性降低的情况,需要考虑弥散性血管内凝血(disseminateintravasculardisease,DIC)的存在。对纤维蛋白溶解系统各个成分的检测,可以更加明确哪种因素导致了纤维蛋白溶解系统的启动。D-二聚体是纤维蛋白溶解系统的一个重要终产物,其水平的升高代表继发性纤维蛋白溶解活力增强。该试验敏感性强,但特异性非常低。若仅检测到D-二聚体升高就理解为血栓形成,往往会导致临床的误诊。需要指出的是,各种品牌的D-二聚体检测其结果的一致性往往不能令人满意。各种试剂的正常参考范围和排除静脉血栓的医学决定水平各异,并非所有试剂均可以用来排除静脉血栓形成。具有该种能力的试剂,一定需要经过大量阴、阳性标本的能力验证并由权威部门认可。
二、血栓和止血检测在出血病治疗中的作用
缺乏因子的补充替代治疗往往是出血病尤其是凝血因子缺陷症治疗的主要手段。以往,出血病是手术的禁忌证。随着检测技术和生物医药产业的发展,禁区已经被打破。在输注一定剂量的血液制剂后,及时检测患者体内凝血因子的水平,若达到一定高度,就可以抵御手术出血的风险。围手术期定时检测凝血因子的水平并给予维持,可以保障患者围手术期的止血安全。相反,若输注定量凝血因子后,凝血因子的血浆水平未见明显升高,提示患者体内可能存在凝血因子的抑制物存在。若遇该种情况,千万不能贸然手术,而是需要查明检测结果异常的原因,及时给予处理,才能保证手术的顺利实施。接触系统的因子如凝血因子Ⅻ、激肽释放酶原的缺乏往往导致APTT延长,但由于该类因子对止血功能贡献有限,即使缺乏,也不会导致出血的发生。所以,并非每个凝血因子缺乏患者在手术时均需进行所缺因子的替代治疗。
三、血栓和止血检测在血栓病诊断中的作用
血栓病临床上分为遗传性和获得性。体内主要抗凝蛋白如抗凝血酶(antithrombin,AT)、蛋白C(proteinC,PC)、蛋白S(proteinS,PS)的先天性缺乏,可以导致血栓性疾病。对静脉系统血栓病的检测可以发现部分患者具备这种先天性缺陷。但临床上大部分血栓病是各种获得性原因导致的,常用的血栓和止血检测可能无法检测出单一的致栓原因,但可以从血管壁、血小板、凝血、抗凝、纤维蛋白溶解系统的检测中发现一个或几个方面的异常。事实上,除FⅧ:C,vWF:Ag、纤维蛋白原外,常规可以选择的高凝状态检测指标并不多;所谓止凝血过程中所形成的分子标志物临床实际应用价值有限。目前,血栓弹力图(thrombelastogram,TEG)可以检出患者体内的凝血功能和/或血小板功能亢进,为临床诊疗提供依据。
四、血栓和止血检测在血栓病治疗中的应用
肝素和相对分子质量肝素是最常用的肠外抗凝制剂,其作用主要依赖AT质和量的正常。因此,肝素/低相对分子质量肝素抗凝治疗实施以前,必须进行AT活性的检测。若AT活性低于70%,肝素治疗效果降低;AT活性低于50%,则肝素失效。检测中发现这种情况后,要及时补充含AT制剂,国内主要是血浆。以往,肝素治疗的监测指标是APTT。但该指标目前认为有较多局限性。目前,直接检测肝素的含量,对临床更有指导价值。同样,低相对分子质量肝素在一些特殊情况如肥胖、低体重儿童、肾功能缺陷、妊娠患者或治疗期间发生出血或血栓形成的患者也需要实施监测。由于肝素/低相对分子质量肝素的代谢半衰期较短,临床实施检测的时间对结果的准确性来说非常重要。一般肝素监测的采血时间在皮下注射后2或6h,在预防或治疗血栓时,其期望的浓度水平分别是0.1~0.15U/mL(2h)及0.3~0.7U/mL(6h)。低相对分子质量肝素监测时间,每天用药2次者在第1次用药后3~4h;每天用药1次者,在用药后4~6h。在预防血栓时,抗Xa期望的浓度水平是0.1~0.15U/mL;治疗血栓形成时,每天用药1次者抗Xa水平为0.6~1.0U/mL,每天2次用药者抗Xa水平为0.8~1.3U/mL。华法林是最常用的口服抗凝药物,其起效慢,与食物和药物的相互作用使其在临床上必须依赖实验室检测来调节患者的血药浓度。PTINR是监测华法林的最常用指标。同样,抗血小板治疗的有效性与患者的预后也是密切相关的。部分患者服用阿司匹林或氯吡格雷后会出现相应药物的抵抗,严重者可以导致血栓事件的再次发生。目前,可以使用的抗血小板药物的监测手段有血管舒张剂刺激磷蛋白(vasodilator-stimulatedphosphoprotein,VASP)磷酸化程度、TEG和血小板聚集试验等。不同检测有其特有的优势和不足。
五、血栓和止血在优生优育中的应用
由于先天性出血病和血栓病目前尚无法临床根治,且该类疾病具有遗传给后代的特点,如何通过实验室检测的手段进行优生优育干预,阻止患者的出生,是广大检验医学工作者的任务。以遗传性出血病为例,血友病A和B临床最为常见,且其为X染色体伴性隐性遗传。由于男性仅有一条X染色体,一旦被累及,即成为患者;女性具有2条X染色体,1条被累及,为致病基因的携带者,本身不发病,但可以遗传给后代。血友病A的基因诊断可以从先证者着手,优先检测占血友病A重型患者的热点突变即FⅧ内含子22倒位和内含子1,若阳性,直接可以诊断;阴性情况下可以直接行FⅧ外显子测序,多数可以找到突变;仍旧阴性的患者可以通过MLPA检测大缺失以及FⅧ拷贝数检测查找异常;极少数患者可以通过二代测序发现异常。若家系中相关女性被诊断为致病基因携带者,可以在其妊娠中期进行羊水穿刺,获得羊水脱落细胞,寻找是否与先证者具有相同突变来进行诊断。若结果为血友病患者,可以选择终止妊娠。FⅨ基因较小,一般通过直接测序,多可以诊断。为保证检测结果的准确性,血友病的基因诊断一般在直接诊断的基础上,选择FⅧ/Ⅸ基因内外的多态性标志进行间接诊断。在直接诊断与间接诊断二者的结果相符时,才可出具基因诊断报告。目前,植入前基因诊断已经在国内起步。其整合了辅助生殖技术和基因诊断技术,采取从受精卵中获取个别卵裂球进行检测,将正常卵裂球植入母体子宫的策略。理论上可以彻底阻止单基因遗传疾病的发生,母亲避免反复流产的风险。在遗传性出血病和血栓病的优生优育中,有着极其广阔的应用前景。
延伸知识：临床相关疾病的凝血检测
一．凝血障碍性疾病
1．筛选试验
选用APTT和PT作为筛选试验，根据筛选试验的结果，大致有以下四种情况：
（1）APTT和PT都正常：除正常人外，仅见于遗传性和继发性因子ⅩⅢ缺乏症。获得性者常由于严重肝病、肝脏肿瘤、恶性淋巴瘤、白血病、抗因子ⅩⅢ抗体、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血等引起。
（2）APTT延长伴PT正常：多数是由于内源性凝血途径缺陷所引起的出血性疾病，如血友病A、血友病B、因子Ⅺ缺陷症；血循环中有抗因子Ⅷ、抗因子Ⅸ或抗因子Ⅺ抗体存在；DIC时可见因子Ⅷ、因子Ⅸ、Ⅺ减低；肝脏疾病时可见因子Ⅸ、Ⅺ减少；口服抗凝剂时可见因子Ⅸ减少。
（3）APTT正常伴PT延长：多数是由于外源性凝血途径缺陷所引起的出血性疾病，如遗传性和获得性因子Ⅶ缺乏症，获得者常见于肝脏疾病、DIC、血循环中有抗因子Ⅶ抗体存在和口服抗凝剂等。
（4）APTT和PT都延长：多数是由于共同途径缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子Ⅹ、Ⅴ、凝血酶原（因子Ⅱ）和纤维蛋白原（因子Ⅰ）缺乏症；获得性者主要见于肝脏疾病和DIC，口服抗凝剂时凝血因子Ⅹ和凝血酶原减低。此外，血循环中有抗因子Ⅹ、抗因子Ⅴ和抗因子Ⅱ抗体存在时，它们也相应延长。临床应用肝素治疗时，APTT和PT也都相应延长。
2．血友病和血管性血友病的基因诊断：
（1）血友病A：可采用：
a.间接基因诊断
b.直接基因诊断
（2）血友病B：
由于因子Ⅸ基因小，所以血友病B可用直接基因测序的方法来解决：
（3）血管性血友病（vonWillebranddisease,vWD）的基因诊断：
vWD携带者检测和产前诊断也是利用多态性标记进行间接诊断。当然，对于明确缺陷的家系，亦可用缺陷基因作直接诊断。
①可变数目的串联重复顺序（ATCT），其杂合子频率高，在白种人群中杂合子频率为98%；②限制性内切酶片段长度多态性（RFLP），利用这些多态性标记，可对部分家系作携带者检测和产前诊断。
（4）携带者和产前诊断：
目前，对血友病的携带者和产前诊断多采用RFLP分析法，检出家系中血友病患者缺陷基因相连锁的多态性DNA片段，可确定是否为携带者。通过对孕6—11周胎儿绒毛膜组织或羊水细胞DNA的RFLP分析，可确定高危胎儿是否携带疾病基因。国内已开始此项检测。
3．肝脏疾病出血的实验诊断：
据统计约85%的肝病患者有一项或一项以上的血栓和止血异常，其中15%的患者有出血倾向，且出血的严重程度与肝功能损害的严重有正相关关系。
肝病出血的原因甚为复杂，除涉及血小板异常外，主要与以下几个方面有关：
（1）凝血因子和抗凝蛋白的合成减少；
（2）凝血因子和抗凝蛋白的消耗增多；
（3）循环抗凝物质和血中FDP增多。
诊断肝病时，对病情和判断预后有价值的指标是：
（1）因子Ⅶ︰C和Ⅱ︰C减低，先于肝功能异常，可作为肝病早期诊断的指标之一；
（2）Fg和因子Ⅴ︰C减低，反映肝病严重，或进入肝硬化；
（3）异常凝血酶原增高是诊断原发性肝癌的参考指标之一；
（4）因子Ⅷ︰C和vWF︰Ag水平越高，反映肝病越严重，因子Ⅷ︰C降低提示并发DIC；
（5）因子ⅩⅢα︰Ag、ATⅢ的水平低于35%或Plg的水平低于20%时提示预后不佳；
（6）肝病时常呈多个因子的联合变化，故需综合分析。
二．血栓栓塞性疾病
1．筛选试验：
可选用FDP和D-D作为纤溶系统活性的筛选试验，根据筛选试验的结果，
大致有以下四种情况：
（1）FDP和D-D均正常：表示纤溶活性正常，临床的出血症状可能与原发性和继发性纤溶无关；
（2）FDP阳性伴D-D阴性：理论上只见于纤维蛋白原被降解，而纤维蛋白未被降解，即原发性纤溶。实际上这种情况属于FDP的假阳性，见于肝病、术后大出血、重症DIC、纤溶初期、剧烈运动后、类风湿因子阳性、抗Rh（D）抗体存在等。
（3）FDP阴性伴D-D阳性：理论上只见于纤维蛋白被降解，而纤维蛋白原未被降解，见于血栓栓子自发性溶解，实际上这种情况属于FDP的假阴性，见于DIC、静脉血栓、动脉血栓和溶栓治疗等；
（4）FDP和D-D均阳性：表示纤维蛋白原和纤维蛋白同时被降解，见于继发性纤溶，如DIC和溶栓治疗。
2．血栓前状态：
3．易栓症：
易栓症包括血栓栓塞的抗凝蛋白缺陷、凝血因子缺陷、纤溶成分缺陷以及代谢障碍等疾病。
4．纤维蛋白溶解综合征：
包括原发性纤溶和继发性纤溶两种。
（1）原发性纤溶症：是由于纤溶酶原激活物（t-PA,u-PA）增多导致纤溶酶活性增强，后者降解血浆纤维蛋白原和多种凝血因子，使它们的血浆水平及其活性降低。虽称“原发性”但常见于①引起纤溶酶原激活物（t-PA,u-PA）增多或活性增强的疾病，如胰腺、前列腺、甲状腺等手术或过度挤压时；②引起纤溶抑制物（PAI，α2-PI）减少或活性降低的疾病，如严重肝病、恶性肿瘤、中暑、冻伤和某些感染等。除APTT、PT、TT可能延长外，重要的是血浆Fg含量明显降低，优球蛋白溶解时间（ELT）明显缩短，血、尿FDP明显增高，血浆Plg减低和（或）PLm活性增高，PAI和（或）α2-PI活性减低，t-PA和u-PA活性增高，纤维蛋白肽Bβ15-42水平增高。但是3P试验阴性，纤维蛋白肽Bβ15-42和D-二聚体多正常。（见表3）
（2）继发性纤溶症：
主要见于弥漫性血管内凝血（DIC）的继发性纤溶期（表3）。目前研究的重点是DIC前期(pre-DIC)的诊断，它指有DIC的病因存在和凝血-纤溶反应的异常，但尚未达到DIC的确诊标准。此对DIC的早期诊断和早期治疗甚为重要。它的诊断列表4。
三．抗栓治疗的监测
临床上常用抗凝药以预防血栓形成，也用溶栓药以溶解血栓。但是，这些药物应用过量便会造成出血，用量不足又达不到预期疗效。因此在应用这些药物的过程中，必须作实验室监测。
1．普通肝素和低分子量肝素的监测：
应用普通肝素（uFH）出血发生率约为7～10%，血小板减少的发生率约为0～5%。较大计量的低分子量肝素（LMWH）也有出血的可能。
①uFH：选用APTT监测：使APTT较正常对照延长1.5～2.5倍或选用uFH血浆浓度测定，使其维持在0.2～0.4IU/ml。但在体外循环应用uFH抗凝时，可选用活化的凝血时间（ACT），参考值为60～秒，使其维持在～秒为宜。
②LMWH：较大剂量LMWH也需监测：可选用heptest,参考血浆为17.1±2.1秒（范围13～20秒），维持在参考值的4倍可达到治疗的效果。此外，也可选用因子Ⅹa抑制试验（抗因子Ⅹa活性测定），使其维持在0.2～0.5AⅩaIU/ml为宜。然而，无论应用uFH或LMWH，均需测血小板计数，使其维持在正常范围内，若低于50×/L需停药。由于肝素抗凝需依赖ATⅢ，故需测定血浆ATⅢ活性（ATⅢ:A）,使其维持在80～%之间。
2．口服抗凝剂的监测：
由于应用剂量过大或个体差异性的缘故，口服抗凝剂的出血发生率约为7.1～20.5%，可选用：
①血浆凝血酶原时间比率（PTR）：使其维持在1.5～2.0为佳，若PTR超过2.0时其出血并发率增加22%,若PTR低于2.0时其出血并发率仅为4%。此外，也可选用国际标准化比率（INR），一般中国人维持在2.0～2.8之间为宜（国外范围为1.0～4.0）。
②凝血酶片段1+2（F1+2）：现知，口服抗凝剂首先使半衰期短的FⅦ的血浆水平减低，以后才使FⅩ、凝血酶原和FⅤ减低，故选用F1+2作监测指标更为确切。F1+2的参考值为0.4±0.23nmol/L(范围0.11～1.19nmol/L)，口服抗凝剂患者维持在0.1±1.5nmol/L为宜。
3．溶栓治疗的监测：
溶栓治疗的主要并发症是出血，轻度出血的发生率为5～30%，重度出血为1～2%。可选用纤维蛋白原（Fg）、凝血酶时间（TT）和纤维蛋白（原）降解产物（FDP）作为实验室监测指标。当Fg＜1.5g/L,TT＞正常对照3倍，FDP＞μg/ml时，其临床出血并发症增加3倍。因此，目前多数作者认为，维持Fg在1.2～1.5g/L,TT＞正常对照1.5～2.5倍，FDP在～μg/ml时最为适宜。
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