作者：陈丹娜
单位：医院
目的：探讨一个东南亚型遗传性持续性胎儿血红蛋白增多症（SEA-HPFH）复合β-及α-地中海贫血家系的表型与基因型关系。方法：采集家系成员外周血，进行红细胞指标、血红蛋白电泳分析和地贫基因常规检测；采用跨越断裂点PCR（Gap-PCR）、Sanger测序技术分析缺失型β-地贫基因型；通过Sanger测序检测Aγ、Gγ启动子突变。结果：先证者（中间型地贫）为一种罕见的SEA-HPFH复合β-（IVS-II-）及α-地贫（-α3.7）三重杂合子，其SEA-HPFH及α-地贫基因遗传自母方，β-地贫基因遗传自父方。先证者及其母均存在Aγ：+25GA复合Gγ：-CＴ杂合突变。结论：SEA-HPFH是一种罕见的β珠蛋白基因缺失，血常规参数正常或者接近正常，血红蛋白F（HbF）常明显增高。当出现血液学表型与基因型不符时，应进一步检测罕见基因型以避免漏诊或误诊，这有助于指导临床诊断、人群筛查和遗传咨询。
地中海贫血；东南亚型遗传性持续性胎儿血红蛋白增多症；基因型；基因诊断
地中海贫血（thalassemia，简称地贫）是我国南方地区常见的一组遗传性溶血性疾病，分为α-地贫和β-地贫[1]。α-地贫主要是α-珠蛋白基因缺失导致；β-地贫主要缘于β-珠蛋白基因点突变，少数由β-珠蛋白基因簇大片段缺失导致[2]。SEA-HPFH是一种以高HbF为表型的β-地贫基因缺失突变，首先发现于越南和柬埔寨裔患者中，故称东南亚型（或越南型）HPFH[3]。我们对一个包括2例杂合型SEA-HPFH的地贫家系进行了表型与基因型关系的探讨，报告如下。
1.对象与方法
1.1对象
先证者，男，14岁（图1II1），来自广东东莞，因“发热4天、发现贫血1天”至本院住院治疗。贫血貌，巩膜轻度黄染，脾大，无输血史。检查发现中间型地贫表型合并轻微缺铁性贫血（Fe：6.2μmol/L），与常规地贫初筛基因型（-α3.7/αα，βIVS‐II‐/βIVS‐II‐）的重型地贫不符，需进一步完善基因诊断。
图一：家系图
1.2血液学表型分析
在征得知情同意后采集患者及父母外周静脉血各2mL（EDTA-K2抗凝）。采用ADVIA全自动血细胞分析仪（德国Bayer公司）进行各项红细胞指标分析，采用Capillarys2全自动毛细管电泳（法国Sebia公司）进行血红蛋白组份分析。
1.3地贫基因常规检测
用全血DNA（离心柱型）试剂盒提取外周血gDNA。采用Gap-PCR法检测常见的3种缺失型α-地贫（--SEA、-α3.7和-α4.2），采用反向斑点杂交法（RDB）检测常见的3种非缺失型α-地贫（QS、CS和WS）和17种β-地贫点突变。
1.4缺失型β-地贫检测
采用Gap-PCR法检测缺失型β-地贫。
1.5确认断裂点
参照文献[4]（表1），利用三引物双重Gap-PCR扩增原则，HPFH-F/HPFH-RW、HPFH-F/HPFH-RM分别扩增野生型（bp）、缺失型（bp）SEA-HPFH区域。将产物送Invitrogen公司进行Sanger测序以确定具体断裂点。
1.6γ-珠蛋白基因启动子突变分析
参照文献[5]，引物Ag1/Ag2、Gg1/Gg2（表1）分别扩增Aγ和Gγ基因启动子并测序。
表一：PCR引物序列
2.结果
2.1血液学表型分析结果
先证者父亲（I1）为MCV、MCH降低，HbA2增高的典型小细胞低色素表型，提示β-地贫点突变携带者；先证者（II1）为MCV、MCH和HGB均降低的中度小细胞低色素贫血表型，但血红蛋白HbA2不增高，HbF明显增高，提示缺失型β-地贫携带者；先证者母亲（I2）其它各项血液学指标基本正常，但HbA明显降低，而HbF明显增高，提示缺失型β-地贫携带者（表2）。
表二：血液学表型和基因型
注：?未提及检测α-地贫；?患儿年龄为7M，患儿同时合并GA突变型G6PD纯合子
2.2地贫基因常规检测结果
先证者父亲常规地贫检测为（αα/αα，βIVS-II-/β），与表型相符；先证者母亲常规α-地贫检测为-α3.7/αα，但β-地贫基因未见异常，与表型不符；先证者常规α-地贫检测基因型为-α3.7/αα，而β-地贫检测疑似为βIVS-II-纯合子，与表型不符（图2）。
图二：家系成员地贫常规检测结果2A：常规缺失型α-地贫Gap-PCR电泳图，先证者及母亲基因型为-α3.7缺失携带者，父亲未见常见缺失；2B：家系三人常规非缺失型α-地贫PCR-RDB结果均未见常见非缺失；2C：常规非缺失型β-地贫PCR-RDB结果，父亲为β-地贫IVS-II-携带者，先证者疑似为IVS-II-纯合突变，母亲未见常见非缺失。
2.3缺失型β-地贫检测结果
Gap-PCR检测缺失型β-地贫，结果显示先证者、母亲均为SEA-HPFH携带者，父亲未见异常（图3A）。进一步测序得出缺失范围为：NC_.10:-，即SEA-HPFH基因型（图3B）。
图三：家系成员缺失型β-地贫基因检测结果3A：缺失型β-地贫Gap-PCR电泳图，、、、和bp分别为内参、正常、Gγ+(Aγδβ)0、SEA-HPFH和Taiwanese条带；3B：先证者及其母SEA-HPFH断裂点测序结果，缺失范围为NC_.10:-del。
2.4γ-珠蛋白基因启动子突变测序结果
先证者及其母均检出珠蛋白基因启动子区域Aγ：+25GA（rs）和Gγ：-CＴ（rs）杂合突变，父亲未见异常（图4）。
图四：家系成员Aγ和Gγ基因启动子区测序结果箭头所指为突变位置
3.讨论
地贫是一种发病率较高的血液系统遗传病，我国南方为高发地区。广东地区α-及β-地贫突变携带率分别高达8.53%和2.54%[9]。我国目前已报道5种大片段缺失型β-地贫：Gantonese型，Yunnanese型，Chinese型，S.E.Asian（SEA-HPFH）型和Taiwanese型[10]。本文先证者的基因型最终确诊为（-α3.7/αα，βIVS‐II‐/βSEA‐HPFH），这种三重复合地贫基因型十分罕见，在全世界首次报道。SEA-HPFH于年由Motum等[11]首次报道，其缺失范围为27kb长的β-珠蛋白基因簇上的β-基因及3′-HS-1区。3′-HS-1区缺失使HPFH-3并置到γ基因上游的增强子，导致HbF持续表达而增加。
当前缺失型β-地贫不在常规试剂盒检测范围内，临床医生也知之甚少，易使SEA-HPFH漏检。当发现血液学表型与基因型不符时，须进一步检测罕见或未知突变基因型避免漏诊或误诊。基于表型与基因型相结合的诊断原则，本研究先证者的血液学及临床症状提示为中间型地贫表型，但常规地贫初筛为重型β-地贫（-α3.7/αα，βIVS‐II‐/βIVS‐II‐）；有文献报道[6,7]重型βIVS‐II‐患者未经输血治疗HGB常低至40g/L以下（表2），因此本文先证者表型与基因型不符；根据其父（αα/αα，βIVS-II-/β）及其母（-α3.7/αα，β/β）的初筛结果可知其基因型不符合孟德尔遗传规律，且先证者及其母HbF明显增高，因此考虑他们是否携带HPFH或β-地贫其他罕见缺失或点突变；进一步缺失型β-地贫Gap-PCR检测发现先证者为SEA-HPFH携带者，遗传自及其母，缺失范围与HeS等[8]报道相符，基因型符合孟德尔遗传规律。
SEA-HPFH携带者由于γ珠蛋白合成增加补偿了β链的减少，使得地贫症状不明显，如家系中的母亲；但SEA-HPFH与β-地贫双重杂合时，可导致中间型β-地贫，临床表现为中度或重度贫血，如先证者[3]。HeS[8]和HLTThanh[3]等报道了（αα/αα，βIVS‐II‐/βSEA‐HPFH）患者（表2），此外有研究报道，SEA-HPFH携带者的HBF水平与α珠蛋白基因数正相关[12]，而本文先证者缺少了一个α基因，理论上HBF应95%，这与实际的96.5%相悖，我们猜测是否其它修饰因素导致。测序发现，先证者及其母γ基因启动子均存在Aγ：+25GA和Gγ：-CＴ杂合突变，ChenD等[13]报道这两个多态性可提升HBF表达以缓解β地贫严重性，这可能解释了先证者HBF和MCV、MCH比文献报道的两例患者略高的原因，也充分说明中间型β-地贫的表型变化范围宽，分子基础相对复杂，具有很大的遗传异质性。先证者当前生活质量较高（HGB80g/L），但若继续未行输血等治疗将来可出现不同程度的骨质疏松、心衰等[10]。其将来婚育，若配偶是β-地贫或（和）α-地贫携带者，孕妇可通过有创性产前诊断（绒毛取材术、羊膜腔穿刺术和脐静脉穿刺术），行基因检测判断胎儿是否为中间型或重型地贫。
本研究发现首个SEA-HPFH复合β-（IVS-II-）及α-地贫（-α3.7）三重复合地贫家系，明确了其基因突变类型，丰富了中国人群复合地贫基因突变谱，有助于指导此病的人群分子筛查、临床基因诊断、产前基因诊断和遗传咨询。
利益冲突无
参考文献
[1]LinL,ChenD,GuoJ,etal.Developmentofacapillaryzoneelectrophoresismethodforrapiddeterminationofhumanglobinchainsinαandβ-thalassemiasubjects.BloodCells,Molecules,andDiseases,,55(1):62-67.
[2]EdisonES,VenkatesanRS,GovindanattarSD,etal.Anovel26bpdeletion[HBB:c.20_45del26bp]inexon1ofthebeta-globingenecausingbeta-thalassemiamajor.HEMOGLOBIN,,36(1):98-.
[3]LyThiThanhH,LeThiThanhH,HoangLuongL,etal.PrenataldiagnosisofacasewithSEA-HPFHdeletionthalassemiawithwholeHBBgenedeletion.TaiwaneseJournalofObstetricsandGynecology,,57(3):-.
[4]龙驹,颜善活,劳可干,等.产前诊断中地中海贫血--THAI型和HPFH-SEA型的基因检测.中国优生与遗传杂志.(02):20-22.
[5]李园园,陈萍,肖旋,等.珠蛋白基因Aγ-C→T突变导致nd-HPFH的研究.广西医科大学学报.(02):-.
[6]崔金环,郑雪莲,区丽群,等.中重型β地中海贫血基因类型分析.中国优生与遗传杂志.(01):32-33.
[7]林芬,吴教仁,童欣,等.江西一例β地中海贫血纯合子合并G6PD缺乏纯合子的分析.中国优生与遗传杂志.(07):27-28.
[8]HeS,WeiY,LinL,etal.Theprevalenceandmolecularcharacterizationof(δβ)0-thalassemiaandhereditarypersistenceoffetalhemoglobinintheChineseZhuangpopulation.JCLINLABANAL,,32(3):e.
[9]XuXM,ZhouYQ,LuoGX,etal.TheprevalenceandspectrumofalphaandbetathalassaemiainGuangdongProvince:implicationsforthefuturehealthburdenandpopulationscreening.JCLINPATHOL,,57(5):-.
[10]徐湘民,张新华,陈荔丽.地中海贫血预防控制操作指南.北京:人民军医出版社.:16-20.
[11]MotumPI,HamiltonTJ,LindemanR,etal.MolecularcharacterisationofVietnameseHPFH.HUMMUTAT,,2(3):-.
[12]秦文斌,E.Baysal,岳秀兰,等.东南亚型遗传性胎儿血红蛋白持续增多症或东南亚型β°-地中海贫血.包头医学院学报.(02):87-91.
[13]ChenD,ZuoY,ZhangX,etal.AGeneticVariantAmelioratesβ-ThalassemiaSeveritybyEpigenetic-MediatedElevationofHumanFetalHemoglobinExpression.TheAmericanJournalofHumanGenetics,,(1):-.
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